stomatologia dziecieca warszawa czesc 4

Studzienki płytek do mikromiareczkowania z polichlorku winylu (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) napełniono 100 ul oczyszczonego przez powinowactwo anty-PTHRP (37 do 74) w 200 mM buforze boranowym (pH 8,4) i inkubowano przez noc w 4 ° C. Po płukaniu studzienki blokowano 300 .l 1% albuminy surowicy bydlęcej w buforze boranowym przez dwie godziny w 25 ° C i ponownie płukano. Próbkę lub wzorzec testu (200 .l) dodano do podwójnych dołków w 4 ° C i inkubowano przez noc w 4 ° C. Po przemyciu 100 .l anty-PTHRP znakowanego radioaktywnie (1-36) w buforze PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 10 mmol na litr [pH 7,4] -0,1 procent albuminy z surowicy bydlęcej-0,1 procent Triton X-100) z do studzienek dodano procent normalnej surowicy królika i inkubowano przez noc w 4 ° C. Po ostatnim płukaniu zliczano odwierty. Jako wzorzec testu normalne ludzkie osocze, w którym nie wykryto PTHRP, uzupełniono syntetycznym PTHRP (1 do 74) w stężeniach 0,8, 1,6, 4,0, 8,0, 20, 40, 100, 200, 500 i 1000 pmol na litr . Czułość testu immunoradiometrycznego na PTHRP (1 do 74) wynosiła pmol na litr, a wiązanie specyficzne było proporcjonalne do stężenia do 1000 pmoli na litr (Fig. 2A). Test immunorezystancyjny był wysoce swoisty dla PTHRP (1 do 74), ponieważ PTHRP (1 do 36) był wykrywalny tylko w stężeniach powyżej 1000 pmol na litr (prawdopodobnie dlatego, że niektóre przeciwciała anty-PTHRP (l do 36) były obecne w antygenie -PTHRP (37 do 74)), podczas gdy PTHRP (37 do 74), PTHRP (109 do 138) i hPTH (1 do 84) (ludzki parathormon) w stężeniach do 100 000 pmoli na litr były niewykrywalne. Zmienność śróddzienna wynosiła średnio 6,6 procent, a zmienność między testami wynosiła 13,1 procent. Jedna próbka osocza zdrowego osobnika wykazywała bardzo wysoki poziom wiązania w teście immunoradiometrycznym. Problem ten został w znacznym stopniu złagodzony przez dodanie 1% normalnej surowicy króliczej do testu (jak opisano powyżej) i został przypisany heterofilowym przeciwciałom anty-IgG skierowanym przeciwko IgB.25 Aby zweryfikować swoistość, kolumnę immunopowinowactwa anty-PTHRP przygotowano przez kowalencyjne sprzęganie oczyszczonego z PTHRP (l do 36) do białka A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) i standardy testu przepuszczono przez kolumnę; przepływ (osocze, które przeszło przez kolumnę) zawierał mniej niż 5 procent oryginalnej zawartości PTHRP, co wskazuje na 95 procent ekstrakcji. Próbki wszystkich próbek osocza o wysokim wiązaniu w oznaczeniu immunoradiometrycznym przepuszczano przez kolumnę i oryginalną próbkę osocza powtórnie testowano razem z próbką przepływową. Wyniki podano jako różnicę – tj. Immunoreaktywność pierwotnej osocza minus immunoreaktywność frakcji przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, frakcja przepływu 11% próbek zawierała pewien immunoreaktywny materiał, a wyniki wymagały korekty, jak opisano powyżej.
PTHRP (109 do 138) Test radioimmunologiczny
W przypadku radioligandu radioimmunologicznego Tyr109-PTHRP (109 do 138) znakowano 125I zgodnie z metodą Enzymobead. Wzorzec próbki lub oznaczenia (100 .l) i antyserum R-22 rozcieńczone 1: 2500 w buforze PBT (100 .l) inkubowano w dwóch powtórzeniach przez noc w 4 ° C, Jodowany PTHRP (109 do 138) o aktywności 2000 cpm w PBT bufor (100 .l) dodano i probówki inkubowano przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 4 ° C
[przypisy: bezpieczna praca przy komputerze, odpornosc humoralna, nozdrza tylne ]