Mutacja JAK-2 w funkcji M2 w zaburzeniach mieloproliferacyjnych ad 7

Immunoprecypitację (IP) przeprowadzono z mysim monoklonalnym przeciwciałem monoklonalnym 4G10 (pTyr) przeciw fosfotyrozynie, a następnie metodą Western blotting (WB) z użyciem przeciwciał przeciwko JAK2 lub STAT5, jak wskazano. Poziomy ekspresji białek JAK2 i STAT5 w lizatach stosowanych do immunoprecypitacji wizualizowano przez immunoblotting z użyciem odpowiednich przeciwciał i pokazano na dole. Aby zbadać, czy mutacja V617F ma konsekwencje funkcjonalne, przeanalizowaliśmy dane dotyczące endogennych kolonii erytroidalnych u 180 pacjentów z zaburzeniami mieloproliferacyjnymi. Endogenne kolonie erytroidalne były obecne u 77 z 87 pacjentów z mutacją V617F, podczas gdy tylko 57 z 93 pacjentów bez mutacji miało je (P <0,001 według dokładnego testu Fishera). Następnie eksprymowaliśmy białko JAK2 V617F w mysiej linii komórkowej BaF3 zależnej od interleukiny-3 (Figura 4). Te transfekowane komórki były nadwrażliwe na niskie stężenia interleukiny-3 i były liczniejsze (podwyższona wartość początkowa) niż komórki kontrolne przy braku interleukiny-3 (Figura 4A). Te same wyniki uzyskano w czterech niezależnych eksperymentach i w analogicznych eksperymentach z komórkami BaF3, które były podwójnie transfekowane genem receptora erytropoetyny i JAK2 oraz w komórkach ludzkich ludzkich komórek UT-7 / TPO transfekowanych trombopoetyną (dane nieprzedstawione).
Sygnalizacja interleukiny-3, erytropoetyny i trombopoetyny zależy od JAK2.33,34. Różnice w żywotności komórek były widoczne, gdy transfekowane linie komórkowe BaF3 utrzymywano w pożywce zawierającej surowicę przy braku interleukiny-3 (Figura 4B). Ten wynik sugeruje, że transfekowany mutant JAK2 zwiększał przeżycie komórek pod nieobecność cytokiny. Ponieważ test proliferacji mierzy liczbę komórek po trzech dniach hodowli, wyniki uzyskane w nieobecności interleukiny-3 na Figurze 4A można porównać z wynikami krzywych żywotności w dniu 3 na Figurze 4B: oba wykazują w przybliżeniu dwukrotność liczby żywotnych zmutowanych komórek jako komórek kontrolnych. Przy przechowywaniu w tych samych warunkach przez więcej niż 10 dni, komórki BaF3 transfekowane JAK2 V617F przeżyły, a ich liczba wzrosła o współczynnik 100, podczas gdy komórki transfekowane JAK2 lub kontrolą wektorową typu dzikiego padły (Figura 4C).
Zbadaliśmy również fosforylację białek JAK2 i STAT5 w tych samych warunkach, co w oznaczeniach proliferacji (Figura 4D). Fosforylacja JAK2 była tylko nieznacznie zwiększona w nieobecności lub przy niskim stężeniu interleukiny-3. Bardziej wyraźną różnicę wykryto w fosforylacji STAT5, jednego z głównych substratów białkowych JAK2 (Figura 4D). Przy wyższych stężeniach interleukiny 3 różnice te zniknęły. Różnice w sygnalizacji odzwierciedlały różnice wzrostu i przeżycia obserwowane przy tych samych stężeniach cytokin. Tak więc obecność JAK2 V617F dawała przewagę proliferacyjną i przeżywczą, czyniąc komórki bardziej wrażliwymi na nadchodzące sygnały stymulacyjne.
Korelacje z danymi klinicznymi
Tabela 2. Tabela 2. Charakterystyka związana z mutacją JAK2 V617F. Możliwe skojarzenia pomiędzy mutacją V617F a cechami klinicznymi zostały retrospektywnie przeanalizowane u 244 pacjentów
[podobne: ginekomastia kielce, agencja statystów kraków, torbiel śródpiersia ]
[podobne: przewlekłe zapalenie woreczka żółciowego, odpornosc humoralna, mechanizm słyszenia ]