Mutacja JAK-2 w funkcji M2 w zaburzeniach mieloproliferacyjnych cd

Limfocyty T CD4 + krwi obwodowej izolowano za pomocą sortowania magnetycznego (Miltenyi Biotech). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wytworzono przy użyciu wirowania w gradiencie Ficoll. Komórki błony śluzowej jamy ustnej otrzymano za pomocą szczotek cytologicznych, a DNA z mieszków włosowych wytworzono z oskubanych włosów. Genomowy DNA izolowano przy użyciu zestawu QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Wykrywanie LOH
LOH wykrywano za pomocą fluorescencyjnej polimerazy mikrosatelitarnej z reakcją łańcuchową (PCR) za pomocą sekwencji starterów z publicznych baz danych (wymienionych w Dodatkowym Dodatku, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Próbki analizowano na analizatorze genetycznym DNA (model 3100, Applied Biosystems). LOH uznawano za obecny, jeśli jeden allel wykazał zmniejszenie szczytowej intensywności fluorescencji o ponad 90% w granulocytach, ale dwa allele były obecne w tkankach nieklonalnych (komórki T, PBMC, błona śluzowa policzków lub komórki mieszka włosowego) z tego samego pacjenta.
Analiza liczby kopii genów
Liczbę kopii chromosomu 9p w DNA granulocytów określono za pomocą ilościowej PCR przez porównanie dwóch pojedynczych kopii: jeden w eksonie 14 JAK2 i niescharakteryzowany gen na chromosomie 13. Startery i szczegóły tych testów podano w Dodatek dodatkowy.
Sekwencjonowanie JAK2
Sekwencjonowaliśmy komplementarny DNA JAK2 (cDNA) PCR z odwrotną transkryptazą (RT), stosując siedem par zachodzących na siebie starterów opisanych w Dodatkowym Dodatku (informacje o sekwencji są dostępne na żądanie).
Konstrukty DNA
Zmutowany cDNA JAK2 zamplifikowano za pomocą RT-PCR z użyciem granulocytowego RNA od pacjenta, który był homozygotyczny pod względem mutacji. Dodatek ten zawiera szczegółowe informacje na temat starterów i klonowania wektorów.
Testy proliferacji
Mysią linię komórkową BaF3 zależną od interleukiny 3 i ludzką linię komórkową zależną od trombopoetyny UT-7 / TPO (dostarczone przez dr. N. Komatsu) transfekowano przez elektroporację z JAK2 typu dzikiego (plazmidowy mysi wirus komórek macierzystych [ pMSCV] -Jak2) i zmutowane konstrukty JAK2 (pMSCV-V617F-Jak2). Dodatek uzupełniający podaje szczegóły testów na proliferację i żywotność komórek.
Immunoprecypitacja i Western Blotting
Komórki BaF3 inkubowano w pożywce hodowlanej (RPMI) zawierającej 10 procent płodowo-cielęcej surowicy pod nieobecność interleukiny-3 przez 12 godzin w 37 ° C, po czym różne stężenia interleukiny-3 dodano przez 15 minut. Lizaty komórkowe przygotowano jak opisano wcześniej. 32 Immunoprecypitację i immunoblotting przeprowadzono z użyciem przeciwciał poliklonalnych przeciwko JAK2 (Upstate) i STAT5 (Santa Cruz) i swoistemu wobec fosfotyrozyny mysiemu monoklonalnemu przeciwciału 4G10 (Upstate).
Analiza statystyczna
Użyliśmy testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, gdzie stosowne, aby porównać zmienne kategoryczne wśród grup, które zostały skategoryzowane zgodnie ze stanem mutacji (heterozygotyczny, homozygotyczny lub dziki) i test U Manna-Whitneya lub test Kruskala-Wallisa na porównuj zmienne ciągłe między grupami. W przypadku niektórych analiz heterozygotyczne i homozygotyczne grupy pacjentów łączono i porównywano z pacjentami bez mutacji JAK2.
Wyniki
Fine Mapowanie wspólnego regionu 9pLOH
Rysunek 1
[przypisy: badanie błędnika kraków, mięsień zębaty przedni, medline odzież medyczna ]
[patrz też: sok trzustkowy, skład soku trzustkowego, torbiel śródpiersia ]